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日期:2021-03-15 21:11:19 浏览量: 74

四、脂质体(脂质体)载体(一)根癌农杆菌和冠状胆瘤(二) Ti质粒和T-DNA的结构和功能(三) T-DNA转移(四) Ti质粒载体和植物就像人类一样,会产生多种肿瘤和癌症,一种叫做胆汁的肿瘤,有很多类型的胆汁,引起胆汁的因素有:伤害,昆虫,病毒,细菌和特定基因人们最感兴趣的胆囊是冠胆瘤,其原因是根癌土壤杆菌(Rhizobiaceat)在植物上的感染引起的。冠胆瘤的感染过程是细菌通过伤口进入植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达,刺激植物细胞不受控制的分裂并形成肿瘤(1) 45杀死感染植物的根癌农杆菌,植物组织仍然可以形成癌症。养育没有生长素和细胞分裂素的培养基上的肿瘤组织可以无限制地分裂和生长(2)放射性致癌芽孢杆菌感染植物并产生两种物质:植物激素和阿片类物质。植物激素使细胞大量增殖ti质粒图谱,并出现冠状胆囊肿瘤。阿片素是由受感染的植物组织(包括胭脂碱,章鱼碱等)合成的稀有氨基酸。冠gall是根癌农杆菌的C,N和能量来源。 (3)根癌土壤杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有一个称为Ti(肿瘤诱导)的质粒(Ti质粒)。

Ti质粒(1) Ti质粒是根癌土壤杆菌染色体外的遗传物质。它是一种双链共价封闭的环状DNA分子aoa平台 ,分子量为95-156 10 D,约200 kb。据发现,农杆菌中还有其他质粒,称为隐性质粒,其功能尚不清楚,有人认为它们可能是有缺陷的Ti质粒,到目前为止,已分离出不同类型的根癌农杆菌。 (2) Ti质粒物理图谱:Ti-DNA上限制性核酸内切酶片段的排列顺序。Ti物理图谱的构建:使用琼脂糖凝胶电泳对片段进行限制性内切酶处理后的Ti质粒DNA分离可以发现有20多个不同大小的DNA片段,然后对这些消化的片段进行分子杂交分析,顺序为确定后,再整理成完整的实物图。基因图的构建:转座子标记方法使用细菌转座子(transposon)在Ti质粒中引起插入和缺失突变。细菌转座子带有各种抗生素抗性基因,可以在转化过程中插入到Ti质粒中,因此根癌农杆菌具有相应的抗生素抗性,因此可以很容易地筛选出转座子内含的Ti质粒突变体。因为转座子插入位点的编码基因是失活的,所以可以通过Ti质粒的限制进行分析。 Dicer片段的变化,例如某些片段的消失或电泳迁移率的变化,决定了这些基因的插入位置,并与突变体的表型相对应,从而建立了Ti质粒的遗传图谱。

图5-5图Tiplasmid显示一些重要的冠状病毒诱导Nopaline Ti质粒基因图谱(显示Ti质粒上产生冠状瘤的几个重要基因位点)5-6 Octopine型pTiAch5和Nopaline型pTiC58Ti质粒基因图谱(引自John et al。199 8):主要功能区域:同源区域T-DNA区域(转移的DNA区域):当农杆菌感染植物细胞时,从Ti质粒中切割并转移T-DNA到达植物的一段DNA细胞称为转移DNA,该DNA片段上的基因以及肿瘤的形成可能在转化的植物细胞的二倍体基因组中包含一个或几个(最多)T-DNA拷贝T-DNA胭脂碱类型T的结构-DNA是15 kb长的DNA连续片段,占Ti的7-15%,两侧都有23 bp的定向重复,章鱼碱型T-DNA分为两部分,左侧区域(TL -DNA)为一个13kb的单拷贝序列,这对于诱导并维持肿瘤。右侧区域(TR-DNA)是7kb的多拷贝序列。 T-DNA通常相对完整,并整合到植物基因组中,而不会改变In序列。 T-DNA携带遗传信息致癌基因:用于转化植物细胞的基因,使植物能够繁殖不受控制的致癌基因(onc基因)。

冠胆合酶及其分解基因:使植物细胞合成某些冠胆氨基酸的基因。诸如nos(编码胭脂碱合酶的基因)和ocs(编码章鱼碱合酶的基因)的Vir区(毒力区):这是转化所必需的。该区段上的基因可以激活T-DNA转移并导致农杆菌具有毒性,因此被称为毒性区。也称为毒力基因或Vir基因或致病基因。 T-DNA区和Vir区在质粒DNA上彼此相邻,它们一起占Ti质粒DNA的约三分之一。病毒的位置:位于Ti质粒上T-DNA的左侧,两者之间的距离通常随Ti质粒的类型而变化。章鱼碱型和胭脂碱型之间的距离很小。 Vir基因结构:章鱼碱型Ti Vir区:40kb,包含8个操纵子,24个基因[VirA(1),B(1 1),C(2),D(4) Nopaline有7个操纵子,Vir基因功能A.细菌附着在受损的植物细胞上B. Vir基因产物加工T-DNA形成单链DNA片段,转移CT链(T链) DT-DNA基因表达到植物细胞中,并整合到宿主基因组中,从而使植物细胞增殖并产生冠状Con区(区域编码结合):在此区段上与细菌间接结合整合转运相关基因(tra)调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。

冠胆碱可以激活tra基因并诱导Ti质粒的转移,因此被称为共轭转移编码区。复制):该区段基因调节Ti质粒的自我复制起始。 Ti质粒来自细菌(原核)系统。为什么其基因可以在真核生物中表达? T-DNA产生的证据1. mRNA是典型的植物mRNA分子。它可以被植物RNA聚合酶II转录,并具有5​​'帽结构和3'polyA尾巴。证据2. nos,ocs和其他基因的5'末端具有真核生物特异性的TATA-box和CAAT-box。结论:T-DNA基因序列只能被真核生物识别,不能被原核生物识别。这表明这些基因可以在真核细胞中表达,并且仅在转化为真核细胞后才能表达。 Vir基因诱导的细菌靠近易受伤害的植物。受伤的植物产生酚类物质(例如烟草组织产生的乙酰丁香酮),从而诱导Ti中Vir基因的表达。章鱼碱型(ocs)Ti质粒具有8个Vir操纵子:VirA,VirB,irC,VirD,VirE,VirF,VirG,Vir。胭脂碱型(Nop)具有7个Vir操纵子:VirA,VirB,VirC,VirD,VirE,VirG,Tzs VirA和VirG在结构上表达(1) VirA基因产物VirA蛋白是细菌细胞膜上的疏水蛋白,是一种植物酚类物质如乙酰丁香酮的受体。

(2) VirA蛋白和酚类物质的结合导致VirG基因产物VirG蛋白磷酸化。VirG蛋白是一种转录激活剂。其磷酸化形成可与其他Vir基因启动子相互作用的DNA结合蛋白。结合了特定的12bp序列以开启它们,因此凤凰体育 ,磷酸化将virG蛋白从非活性状态转变为活性状态VirA(膜上的疏水蛋白)VirG VirG-P的激活被VirG VirG-P不表达的基因被激活并开始表达和转录该因子和特定的12bp序列与T-DNA的加工和转移结合在一起[1)农杆菌附着到植物细胞后,它仅保留在细胞间空间中。首先对T-DNA进行加工,剪切并在细菌中复制,然后转化为植物细胞,而不是整个Ti质粒都进入植物细胞。(2) Vir基因操纵子系统被激活,VirD(编码VirD1和VirD2蛋白质,共同确定内切核酸酶活性),在边界重复序列中表达。在特定位点形成切点,导致单链断裂。 (3) T-DNA复制首先是下链(或下链)Cut的25bp重复序列右边界左侧第3和第4个碱基之间的缺口,然后从缺口的3'端,并延伸到左边界的第22个碱基,取代原始的下链形成ssDNA,即T链。VirD蛋白的作用:(1)保护5'端免受攻击通过5'核酸酶;(2) VirE蛋白作为T-DNA进入植物核的指导:编码ssDNA结合到DNA并包裹T链形成核蛋白丝,易于操作。

T链复合物通过细胞膜的运输通常需要在蛋白质N端的信号肽。在特定的肽酶切割信号肽并停止转运后,信号肽可以帮助穿过细菌内膜(IM)。在T链复合物的操作中的活性物质可以是VirB蛋白。根据其功能,Vir B蛋白可分为5类:R:内膜上或内膜中的某些蛋白可能充当T复合物的受体。答:它可以用作能源,也可以作为ATP酶来促进T复合物被泵出细菌细胞。 VirB11可能是这种“ A”蛋白。 C:扮演形成渠道的角色。 VirB4可以是“ C”蛋白。 VirB4是一种富集的蛋白质,没有疏水区域,也没有信号肽。它可能在T链运输中发挥结构性作用,并形成特殊通道结构的至少一部分。 S:载体蛋白起着通过通道携带T复合物的作用。这种蛋白质可能与所有膜成分(内膜和周质)有关。 P:它位于外膜上,可以作为与植物细胞膜结合的受体。细胞结合蛋白; ST复合载体蛋白; C.通道蛋白; A.ATP酶; RT复合体受体; VirD 2.核定位信号; VirE 2.确保T络合物进入膜孔时不受干扰。 (引自Vogel等人,199 2) T-DNA链整合的植物基因组在靶DNA中形成缺口。由于部分展开,5'-3'核酸外切酶消化形成了缺口。单链T-DNA为由于两条链的DNA互补序列较短ti质粒图谱,因此它们退火形成异源双链体。

p-T-DNA末端和靶DNA连接至靶DNA链的互补链以产生切口。使用游离的3'DNA末端作为引物来修复和合成常用的选择标记基因的第二条T-DNA链载体构建(1)自然存在的质粒的首字母大写并用括号括起来博亚体育 ,例如( (2)重组质粒用小写字母p(质粒)表示,后跟两个大写字母:大写字母是指构建质粒的研究人员或已完成此项工作的研究机构,例如:pSCl0l SC(Stanley Cohen名称) ),pMT555:MT(Manchester Technology),曼彻斯特技术学院(3)农杆菌中的质粒通常以名称表示。例如,pTiT37,Ti表示根癌农杆菌,T37代表质粒的编号或分类。(1)靶基因克隆载体:靶基因克隆载体与微生物基因工程相似,通常以多拷贝大肠杆菌小质粒为载体,其功能是保存和克隆靶基因。(2)中间克隆载体:中间克隆载体是通过将大肠杆菌质粒插入T-DNA片段,靶基因,标记基因等而构建的,是构建中间表达载体的基本质粒。 (3)中间表达载体:中间表达载体是含有植物特异性启动子的中间载体,其功能是作为构建转化载体的质粒。[4)解除武装的载体:解除武装的载体为解除武装的载体Ti质粒或Ri质粒,其功能是构建转化载体的受体质粒。

(5)植物基因转化载体:植物基因转化载体是用于将目标基因导入植物细胞的最后一个载体光大彩票 ,因此也被称为工程载体。 T-DNA的结构特征可分为两种转化载体,即一元载体系统和二元载体系统。基因),即“释放”它的“武装” Ti载体,在该载体中,缺失的T-DNA部分被常用的大肠杆菌载体pBR322取代。可将适合克隆到pBR322质粒中的片段与pBR322质粒DNA进行同源重组,并共整合到onc-Ti质粒载体中。(2)共整合质粒首先构建了中间载体,例如E同源片段的大肠杆菌pBR322质粒到Ti质粒A片段的T区,该片段可以在大肠杆菌和土壤杆菌中复制;将靶基因插入片段的适当位置,以使靶基因具有与Ti质粒的T-DNA同源的DNA序列。然后将质粒或结合物转化为含农杆菌的Ti质粒。引入的衍生质粒与原始细胞中的Ti质粒具有同源性,因此可以产生无性配对。通过交换,可以将靶基因转移到Ti质粒中,以产生真实的质粒。带有外源基因的Ti质粒称为共整合质粒。 (3)二进制载体,也称为反式载体,是指由两个T-DNA和与Vir相容的Ti质粒组成的双重质粒系统。

p质粒中的一个包含T-DNA转移所需的Vir区,另一个是DNA转移载体质粒,其宿主范围广泛,包含T-DNA片段。后者的质粒较小,可以在大肠中找到。它在细菌中复制,因此易于操作,可用于插入外源基因。当两个质粒同时存在时,可以恢复T-DNA的转移功能。载体盒:一种质粒系统,将植物标记基因,多个插入位点,细菌标记基因和质粒复制启动子位点整合到一个容器中。载体盒可以保存在大肠杆菌和农杆菌中,并且可以容易地插入各种质粒载体,转座子或噬菌体中。 (1)标记基因必须具备条件:易于检测并且可以进行定量分析。(2)常用的标记基因可以感染Ti质粒等植物并诱导植物产生大量不定根。合成阿片的类型分为农用碱,甘露糖碱和黄瓜碱三种,Ri质粒诱导的合成花冠碱的不定根可以在体外培养,可以繁育成完整的植物,比Ti质粒更方便。 Ri质粒通常用于构建转化载体,使用共整合系统或二元载体系统,CaMV是一种小的双链DNA植物病毒,全长约8kb,分子量5. 210。特征,一个是它具有特殊的不连续点,在DNA链中有一到三个不连续点;另一个是,大多数DNA都具有螺旋结构og真人 ,看起来像超螺旋,这是在下面观察到的。电子显微镜。

在CaMV上有一个35S强启动子,这使其很容易表达插入其上的基因。 CaMV载体系统:(1)互补载体系统:使用有缺陷的CaMV和辅助病毒分子形成互补系统以促进目标基因的插入。(2)混合载体系统:CaMV + Ti,通过引入植物细胞农杆菌,它可以产生典型的病毒感染症状。有利于单子叶植物中转基因的检测。(3) CaMV35S启动子融合基因载体系统:使用其35S启动子。脂质体是由磷脂在水中形成的脂质双层)囊肿状结构,是近晶液晶,分子排列整齐,脂质体的主要成分是磷脂,制备脂质体的主要方法有超声波(单层小囊泡),机械振荡法,透析法,融合法和反向法。蒸腾脂质体空间填充模型脂质体横截面模型(右)1.胞吞作用脂质体靠近细胞,细胞膜凹陷脂质体逐渐被吞噬到细胞中。 2.脂质体的融合作用接近细胞膜以产生融合,从而使内含物或多层脂质体进入细胞。 3.脂质膜和细胞质膜交换脂质以转移到细胞中的交换作用。细胞的脂质体与溶酶体结合,脂质降解并释放出内含物。