99真人 Ti质粒.ppt 47页

日期:2021-03-13 15:13:06 浏览量: 154

1.植物基因工程载体的命名规则2.植物基因工程载体的类型3.植物基因工程载体的构建4.载体构建中常用的选择标记基因(1)天然存在的质粒No 。1每个字母大写并用括号括起来,例如(ColEL)。(2)重组质粒用小写字母p(Plasmid)表示,后跟两个大写字母:大写字母是指构建质粒或进行研究的研究人员完成工作的机构,例如:pSCl01:SC(斯坦利·科恩的名字),pMT555:MT(曼彻斯特技术),曼彻斯特技术学院。(3)农杆菌中的质粒通常在名称中表示。例如,pTiT37,Ti代表对于根癌农杆菌,T37代表质粒的编号或分类。(1)目标基因克隆载体:目标基因克隆载体与微生物基因工程相似,通常是多拷贝E .coli小质粒作为载体,其功能是保存和克隆靶基因。 (2)中间克隆载体:通过将大肠杆菌质粒插入T-DNA片段ti质粒图谱,靶基因,标记基因等中来构建中间克隆载体。它是构建中间表达载体的基本质粒。(3)中间表达载体:中间表达载体是含有植物特异性启动子的中间载体,其功能是构建用于构建转化载体的质粒。(4)解除武装的载体:解除武装的载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒,其功能是构建和转化该载体的受体质粒。

(5)植物基因转化载体:植物基因转化载体是用于将目标基因导入植物细胞的最后一个载体,因此也被称为工程载体,由中间表达载体和解除武装的载体构建而成。根据它的结构特征可以分为两种类型的转化载体,即一元载体系统和二元载体系统* 一、根癌农杆菌和Ti质粒二、 Ri质粒载体三、 CaMV (花椰菜花叶病毒)载体四、脂质体(脂质体)载体(一)根癌农杆菌和冠状胆瘤(二) Ti质粒和T-DNA的结构和功能(三) T-DNA转移(四) Ti质粒载体及其构建植物可产生多种人类肿瘤和癌症,一种类型的肿瘤称为胆汁,胆汁的类型很多,造成胆汁的因素有:损伤,昆虫,病毒,细菌和特异性基因。前组织人们最感兴趣的胆囊是冠状胆囊肿瘤。 1.冠胆瘤的病因是根癌土壤杆菌[根瘤菌] 2.侵染冠胆瘤的过程。细菌通过伤口进入植物,并在遗传水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达,从而刺激植物细胞不受控制的分裂并形成肿瘤。 :在根癌农杆菌电镜下:冠状胆瘤3.冠状胆瘤的一般生物学特性(1) 45℃杀死了根癌农杆菌,感染了植物,植物组织仍然可以形成癌症。

将肿瘤组织培养在不含生长素和细胞分裂素的培养基上,生长素和细胞分裂素可以不受限制地分裂和生长。 (2)根癌土壤杆菌感染植物并产生两种物质:植物激素和阿片类。植物激素使细胞大量增殖,并出现冠状胆瘤;阿片类化合物是由受感染的植物组织合成的,稀有氨基酸,包括胭脂碱,章鱼碱等。 1.根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有称为Ti(肿瘤诱导)质粒(Ti质粒)的化合物。1. Ti质粒(1) Ti质粒是根癌土壤杆菌染色体外的遗传物质。它是一种双链共价闭合环状DNA分子亚博电子竞技俱乐部 ,分子量为95〜156×106D,约200 kb。最近发现农杆菌中还有其他质粒,称为隐性质粒。隐性质粒的功能尚不清楚捕鱼平台 ,有人认为这可能是有缺陷的Ti质粒。已经从植物中分离出蚕豆。 (2) Ti质粒的物理图谱。物理图谱:限制性内切酶消化片段在Ti-DNA上的排列顺序。Ti物理图谱的构建:限制在Dicer处理后的Ti质粒DNA内,通过琼脂糖凝胶电泳分离,并可以证明存在20多个不同大小的DNA片段,然后对这些消化的片段进行分子杂交分析以确定其顺序,然后排列成完整的物理图谱。 :Ti-DNA上的基因序列。

基因图的构建:转座子标记法使用细菌转座子(transposon)在Ti质粒中引起插入和缺失突变。细菌转座子携带各种抗生素抗性基因。可以在转化过程中将它们插入Ti质粒,使根癌农杆菌具有相应的抗生素抗性,方便筛选插入Ti质粒突变体中的转座子。因为转座子插入位点的编码基因是失活的,所以可以通过分析Ti质粒的限制性核酸内切酶片段的变化(例如某些片段的消失或电泳迁移率的变化)来确定这些基因的插入位置。表型,从而建立Ti质粒的基因图谱。胭脂碱型Ti质粒基因图谱(显示在Ti质粒上产生冠状胆囊肿瘤的几个重要基因位点)(4) Ti质粒基因位点和功能区①T-DNA区域(转移的DNA区域):T-DNA是当农杆菌感染植物细胞时,从Ti质粒上切下的一部分DNA转移到植物细胞中,因此被称为转移DNA,该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。包含一个或几个(最多)T-DNA拷贝T-DNA的结构:胭脂碱型T-DNA是15 kb长的连续DNA片段,占Ti的7-15%,两侧均为23 bp靶向重复序列:章鱼碱型T-DNA分为两部分,左侧区域(TL-DNA)是一个13kb的单拷贝序列,是诱导和维持肿瘤所必需的。

右侧区域(TR-DNA)是7kb的多拷贝序列。 T-DNA通常相对完整,并整合到植物基因组中而不改变序列。 T-DNA携带的遗传信息①引起肿瘤的基因:用于转化植物细胞以使植物繁殖不可控制的致癌基因(onc基因)的基因。 ②Coronaine合酶及其分解基因:使植物细胞合成某些冠胆氨基酸的基因。例如nos(编码胭脂碱合酶的基因)和ocs(编码章鱼碱合酶的基因)②病毒区(毒力区):转化是必需的。该区段上的基因可以激活T-DNA转移并导致农杆菌具有毒性,因此被称为毒性区。也称为毒力基因或Vir基因或致病基因。 T-DNA区和Vir区在质粒DNA上彼此相邻,它们一起占Ti质粒DNA的约三分之一。病毒的位置:位于Ti质粒上T-DNA的左侧,两者之间的距离通常随Ti质粒的类型而变化。章鱼碱型和胭脂碱型之间的距离很小。 Vir基因结构:章鱼碱型Ti Vir区:40kb,包含8个操纵子,24个基因[VirA(1),B(1 1),C(2),D(4),E(2) ,F(1),G(1),H(2)(PinF)],它们协同调节,形成调节子,并协同工作。胭脂碱类型具有7个操纵子。

Vir基因功能A.细菌附着在受损的植物细胞上。 B. Vir基因产物处理T-DNA形成单链DNA片段,将CT链(T链)转移到植物细胞中,整合到宿主基因组中,表达DT-DNA基因,植物细胞增殖并产生冠状花素。 ③Con区(编码结合的区域):该部分包含与细菌之间的结合和转移有关的基因(tra),该基因调节Ti质粒在农杆菌之间的转移。 Coronaine可以激活tra基因并诱导Ti质粒的转移,因此被称为共轭转移编码区。 ④Ori区(复制起点):该区段基因调节Ti质粒的自我复制起始。 Ti质粒来自细菌(原核)系统。为什么其基因可以在真核生物中表达?证据1. T-DNA产生的mRNA是典型的植物mRNA分子。它可以被植物RNA聚合酶II转录,并具有5​​'帽结构和3'polyA尾巴。证据2. Nos,ocs和其他基因在5'末端具有真核生物特有的TATA-box和CAAT-box。结论:T-DNA基因序列只能被真核生物识别,不能被原核生物识别。这表明这些基因可以在真核细胞中表达,只有在转化为真核细胞后才能表达。

1. Vir基因诱导2. VirA和VirG在结构上表达3. T-DNA处理和转移4. T-DNA链整合到植物基因组中1. Vir基因诱导细菌处于脆弱状态位置受害植物附近,受害植物产生酚类物质(例如烟草组织产生的乙酰丁香酮),从而诱导Ti中Vir基因的表达。章鱼碱型(ocs)Ti质粒有8个Vir操纵子:VirA,VirB,irC,VirD,VirE,VirF,VirG,Vir H.胭脂碱型(Nop)有7个Vir操纵子:VirA,VirB,VirCti质粒图谱yabo娱乐 ,VirD,VirE, VirG,Tzs 2. VirA和VirG在结构上表达(1) VirA基因产物细菌细胞膜上的疏水蛋白VirA蛋白是植物酚类物质(如乙酰丁香酮)的受体。(2) VirA蛋白与酚类物质,导致VirG基因产物VirG蛋白磷酸化VirG蛋白是一种转录激活因子,其磷酸化形成DNA结合蛋白,可以与其他Vir基因启动子的特定12bp相互作用,并与序列结合以使其启动因此,磷酸化将virG蛋白从非活性状态转变为活性状态酚类激活VirA(膜上的疏水蛋白)VirG VirG-P不表达Vir被激活的基因,并开始表达转录因子和特异性,其12bp后继ce与3. T-DNA的加工和转移结合在一起(1)农杆菌在附着到植物细胞后仅保留在细胞间空间中。

首先对T-DNA进行处理,剪切和在细菌中复制,然后转移到植物细胞中。并非整个Ti质粒都进入植物细胞。 (2)激活了Vir基因操纵子系统,并表达了VirD(编码VirD1和VirD2蛋白,共同决定核酸内切酶活性),在边界重复序列的特定位置形成切点,导致单(3) T-DNA复制首先在底部链(或底部链)的25bp重复序列的右边界的左侧从左至右延伸第3个碱基和第4个碱基,然后从第3个碱基合成新的DNA间隙的末端。它延伸到左边界的第22个碱基,取代了原始的下链形成ssDNA,即T链。VirD蛋白的作用:(1)保护5'末端免受攻击通过5'核酸酶;(2) VirE蛋白的作用,指导T-DNA进入植物细胞核:编码ssDNA结合蛋白,与单链T-DNA结合,并包覆T链核蛋白细丝易于操作(4) T链复合物通过细胞膜的运输通常需要信号肽在蛋白质的N-末端。在特定的肽酶切割信号肽并停止转运后,信号肽可以帮助穿过细菌内膜(IM)。 T链复合物操作的活性物质可能是VirB蛋白。根据其功能,Vir B蛋白可分为5类:R:内膜上或内膜中的某些蛋白可能充当T复合物的受体。答:可用作能量来源和一种ATP。该酶使T复合物从细菌细胞中泵出。

VirB11可能是这种“ A”蛋白。 C:扮演形成渠道的角色。 VirB4可以是“ C”蛋白。 VirB4是一种富集的蛋白质,没有疏水区域,也没有信号肽。它可能在T链运输中起结构作用,并形成特殊通道结构的至少一部分。 S:载体蛋白起着通过通道携带T复合物的作用。这种蛋白质可能与所有膜成分(内膜和周质)有关。 P:它位于外膜上,可以作为与植物细胞膜结合的受体。 P.细胞结合蛋白; S.T复合载体蛋白; C.通道蛋白; A.ATP酶; RT复合体受体; VirD 2.核定位信号; VirE 2.确保T复合物进入膜孔中。时间不受干扰。 (引自Vogel等人,199 2) 4.。T-DNA链整合到植物基因组中,在靶DNA上形成切口。由于部分展开,5'-3'核酸外切酶消化形成了切口。单链T-DNA靠近缺口,因为两条链具有短的DNA互补序列,它们退火形成异源双链体,T-DNA末端和目标DNA连接到目标DNA链的互补链上产生缺口。游离的3` DNA以引物的形式修复合成的第一条两条T-DNA链* * * *道尔顿是原子量的单位D或KD通常用于生物化学,分子生物学和蛋白质组学中,定义为分子的1/12碳12的原子质量,1D = 1 / N g万人牛牛 ,N是阿伏伽德罗常数幸运快三 ,* noc是编码细菌对胭脂碱利用的基因。