凤凰体育平台 农杆菌质粒载体系统的结构,功能与构建

日期:2021-03-10 18:28:49 浏览量: 72

农杆菌介导的遗传转化已成为植物基因工程中最常用的转化策略。如前所述,农杆菌介导基因转移的原因主要取决于农杆菌质粒的存在。随着研究的深入,人们越来越意识到它们:农杆菌质粒是农杆菌染色体之外的遗传物质,是可以实现DNA转移和整合的自然系统。根癌土壤杆菌的Ti质粒和发根土壤杆菌的Ri质粒在结构上有许多相似之处:首先,它们都是双链共价闭合的环状DNA。其次,它们都是巨大的质粒,其中Ti质粒为150〜200kb,Ri质粒为200〜800kb。同样,它们都具有两个与肿瘤相关的区域,即毒性区域(Vir区域,该区域编码能够进行T-DNA转移的蛋白质)和可转移的DNA区域(T-DNA,可以插入植物基因组的区域)。并且可以稳定表达,并且位于该区域的癌基因与肿瘤的形成有关。下面分别介绍了Ti质粒和Ri质粒的结构和功能。

一、根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能

到目前为止,研究人员已经从不同的植物中分离出不同类型的土壤杆菌,并且还对其Ti质粒的结构特征进行了深入研究。根据在诱导的植物冠状胆囊肿瘤中合成的冠氨酸的不同类型,Ti质粒可分为以下四种类型:章鱼碱,胭脂碱和农杆菌碱,阿古诺碱或琥珀丁酸。章鱼碱和胭脂碱是衍生自氨基酸的冠胆碱,农杆菌碱和农杆菌碱属于单糖衍生的冠胆碱。通过限制性内切核酸酶图谱和Ti质粒DNA的基因图谱,已经清楚地了解了不同类型的Ti质粒上基因的分布,结构和功能。研究发现,各种类型的Ti质粒均具有T-DNA区和毒性区(Vir区),这些区控制肿瘤的诱导并在物理上彼此相邻。它们约占Ti质粒DNA总长度的1/3。 Ti质粒的其余部分包括:①包含复制起点(origion,ori)的复制区(复制区),其基因编码的蛋白质调节Ti质粒的自我复制; ②质粒的共轭转移位点(transferby conjugation loci,con),该区段中有一个与细菌(tra)之间的共轭转移有关的基因,负责调节Ti质粒在农杆菌之间的转移。 ③噬菌体P1的专有基因(年龄),细菌素84的敏感性基因(agr)和不相容性基因(incompatibility,inc)(图9- 2)。

ti质粒图谱

图9-2 Ti质粒结构示意图

([一) T-DNA的结构和功能

T-DNA以单拷贝或多拷贝的形式整合到植物的核基因组中,其长度约占质粒DNA全长的10%,但基因结构会根据T.DNA的类型而有所不同。质粒。 T-DNA区由癌基因(癌基因,一个)和两端的边界序列组成。 Nopaline T-DNA是大约23 kb的连续DNA片段,两端具有25 bp的重复序列[分别称为左边界序列(LB-DNA)和右边界序列(RB-DNA)],其编码为共有13个基因。章鱼碱T-DNA的分子结构相对复杂,通常由两个单独的T-DNA片段(TL-DNA区域和TR-DNA区域)组成,两个分离的T-DNA片段各自具有相应的左侧。边界序列和右边界序列。左端的T-DNA(TL-DNA)长约14kb,共有8个基因,主要是控制冠状胆囊肿瘤形成的基因(包括章鱼碱合酶和致瘤基因);右端的T-DNA(TR-DNA)长度约为7 kb,编码5个基因。它主要包含参与冠胆生物合成的蛋白酶基因(包括甘露醇和农杆菌碱合酶基因),但没有与维护冠胆肿瘤相关的基因。章鱼碱T-DNA的这种结构复杂性可能是初始整合后重排,扩增和缺失的结果,但其意义仍不清楚。

章鱼碱型和胭脂碱型的T-DNA区有8-9kb长的DNA片段,称为核心区(或保守区),其序列同源性可达到90%。核心区域主要包含一些癌基因和与鸦片合成有关的两种基因。第一种是由8个基因组成的onc基因簇。核心区的iaaM,iaaH和ipt基因均为肿瘤诱导基因,均与植物激素的合成有关。其中,iaaM和iaaH被称为生长素基因(aux),后来又被称为肿瘤形态芽基因(tumor morphology Shoot,tms)。 iauM(tms 1)基因编码色氨酸单加氧酶,催化色氨酸合成乙酸吲哚乙酸中的第一个反应; iaaH(tms 2)编码吲哚乙酰胺水解酶,其催化色氨酸合成吲哚乙酸。作为吲哚乙酸的酸合成途径,这两种酶共同合成了吲哚乙酸; ipt基因编码异戊烯基转移酶,它利用异戊烯基焦磷酸腺嘌呤合成细胞分裂素的前体。人体是细胞分裂素生物合成途径的第一步。 T-DNA通过同时控制生长素和细胞分裂素的合成破坏植物体,正常的激素平衡最终导致转化的植物组织中形成不规则的肿瘤,第二种是与冠gall的合成有关的基因,这些基因在不同类型的Ti质粒上的分布是不同的新台币。胭脂碱类型有两个基因。 ,一个位于T-DNA的右端,编码胭脂碱合酶(nos);另一个位于T-DNA的左端,编码农杆菌素碱合酶(agrocinopine systhase,acs)。该章鱼碱类型包含四个冠Al碱性合成基因,一个位于TL-DNA的右端,编码章鱼碱合酶(ocs),该酶将色氨酸和丙酮转化为章鱼碱。其他三个基因位于TR-DNA的右端,分别编码农心碱(农藤合酶,ags)和甘露平合酶(mas 1'和mas 2')。同时,还发现ocs基因和ncs基因的启动子在各种植物细胞中具有功能活性。因此,它被广泛用于植物基因工程载体的构建。

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此外银河国际 ,章鱼碱TL-DNA上还有一些具有其他功能的基因。例如,ORF-6b基因被称为大肿瘤形态学(tml),它对肿瘤的生长速度具有调节作用。自发缺失突变和转座子插入突变的结果证明,这些基因的失活不会影响大多数宿主细菌的致癌性,但是对于某些宿主植物的致癌性是必需的。例如,从葡萄藤分离的菌株不同于大多数农杆菌,其诱导范围广泛的双子叶植物,并且其诱导肿瘤的宿主范围受到限制。当TL-DNA区域上的ipt基因失活时,具有特定宿主范围(LHR)的此类菌株将扩大宿主范围并诱导肿瘤发生。研究表明,LHR细菌中的ORF-6b基因影响ipt基因的活性,是特定宿主植物重要的致癌基因。

T-DNA左右端的25bp正向重复序列是保守序列。胭脂碱T-DNA的LB序列为:TGGCAGGATATTGTGCTGTAAAC; RB序列为:TGACAGGATATATTGGCGGGTAAC;章鱼TL-DNA LB序列为:CGGCAGGATATATTCAATTGTAAAT; TL-DNARB序列为:TGGCAGGAATATACCGTTGTAATT。右边界的核心部分为14bp,可以分为两个部分:10bp(CACGATATAT)和4bp(GTAA)。可以看出,右边界序列更为保守,并且在某些情况下左边界序列将发生变化。实验表明,左边界的缺失突变仍会导致肿瘤。右边界的缺失不再会导致肿瘤ti质粒图谱,并且几乎不会发生T-DNA转移。这表明在T-DNA整合过程中,右边界比左边界更重要。此外,在章鱼碱型T-DNA的右侧约17bp处有一个24bp的超载序列(超载序列,OD序列uu彩票 ,TAAGTCGCTGTGTATGTTTGTTTG),这对于有效转移TL-DNA和TR-DNA是必需的,并且与转换效率有关。在胭脂碱T-DNA边界上未发现该序列。如果去除该OD序列,则章鱼碱型农杆菌诱导肿瘤的能力将降低,因此该序列也称为增强子。将其置于25bp边界序列的6kb上游仍可促进T-DNA转移,并可以改善农杆菌的致瘤性。除了保守的左边界和右边界,T-DNA区域中的其他基因和序列与T-DNA转移无关。利用此功能,我们可以在设计载体的部分基因以去除引起肿瘤的基因时,用一块外来DNA插入野生型T-DNA或将其直接替换为一段外来DNA,从而使转化的植物细胞不再具有致癌能力。使用这种改良的非致瘤性解除武装的载体(解除武装的载体),可以将目标基因轻松转移到宿主细胞的染色体上,以获得完整的转基因植物。

(二) Vir区域的结构特征和功能

Vir区的基因与是否可以将T-DNA转移到植物细胞的遗传过程有关华体会体育 ,而Vir区的基因可以使农杆菌具有毒性。 Vir区的总长度约为35kb,由至少6个互补基团组成,分别称为VirA,VirB,VirC,VirD,VirE,VirG。根据表达情况,每个基因座可分为两种类型:一种是组成型表达,在不存在诱导性分子的情况下仍保持一定水平的表达。另一种是植物诱导型表达,该基因必须受到农杆菌感染的植物的伤害。在组织中,表达只能在植物细胞分泌的信号分子的作用下启动。

VirB,VirC,VirD和VirE是诱导型表达; VirA和VirG组成型表达,但是在植物损伤组织分泌的信号分子的诱导下,VirG表达可以增加10倍以上。植物诱导表达特性。

1. VirA区域

VirA区由单个基因组成,大小为2. 8kb,编码一个92kDa的多肽。 VirA区编码与膜结合的受体蛋白(传感器),由周质结构域,接头结构域,激酶结构域和受体结构域组成。膜通道以可能充当ATPase的形式存在,可用于通道装配和输出过程中,并有助于接收植物信号分子以启动毒性区域的表达。 VirA蛋白特别富集在细菌的内膜上。周质结构域位于细胞壁和细胞质之间的间隙中,并与农杆菌染色体毒力(chv)基因片段(11kb)编码的ChvE蛋白相互作用YOBET体育 ,充当“天线”以感测外部信号。结合VirA-ChvE之后,可以将接头结构域暴露于有义酚和碳水化合物化合物信号;它的功能是帮助植物细胞接受植物信号分子,然后启动Vir区的表达。

2. VirG区域

VirG区具有一个1. 2kb大小的单拷贝基因,该基因编码30kDa VirG蛋白(也称为DNA结合激活蛋白)。当磷酸化的VirA蛋白将其磷酸基团转移到VirG蛋白上52位的天冬氨酸残基时,VirG蛋白被激活。 VirG和VirA构成两部分的监管体系。 VirA接收来自外部环境因素的信号,并通过VirG积极调节毒性区中的其他基因。调节VirG有两种方法:①要完全诱导表达,就需要存在具有正常功能的完整VirA和VirG区。 ②在乙酰丁香酮的存在下,在pH 5. 5和磷酸盐饥饿诱导下,VirG可能很高。水平表达,即当植物受到伤害时,VirG将利用其产生的酸性环境条件作为第二个信号来执行两步调节:首先,低pH诱导VirG以增加细菌中VirG蛋白质的水平然后在乙酰丁香酮的作用下,VirG的磷酸化转化为活性形式,从而进一步调节其自身基因和其他毒性区域基因的表达。

3. VirB区域

不同类型的Ti质粒的VirB区编码至少11个开放阅读框(ORF)。基于胭脂碱型Ti质粒VirB区域中11个ORF的预测蛋白质大小类似于实际观察到的蛋白质大小。在章鱼碱型VirB区中也有11个ORF,它们的核苷酸序列与胭脂碱型VirB区具有很大的同源性,但编码区的长度不同。每个ORF(VirB 6除外)在其前面都有一个Shine-Dalgarno(SD)序列,用于进行蛋白质翻译。 SD序列通常位于ATG起始密码子之前5至13个核苷酸,并且是细菌核糖体的识别位点。 5个VirB多肽编码区可使用翻译偶联机制启动合成,也就是说,当下游编码区的起始密码子接近或重叠时,它们首先被转录成9000个以上核苷酸的单链多顺反子转录本。如果使用相邻上游编码区的终止密码子,则下游蛋白质的翻译取决于相邻上游蛋白质的翻译。核糖体与长链mRNA结合,可以减少核酸降解系统的攻击。如果缺少SD序列,则这种偶联作用的能力将大大降低。

由VirB区编码的蛋白质是一种膜转运蛋白,在N端或富含至少20个疏水氨基酸残基的疏水区具有信号。据推测,VirB蛋白的亚细胞定位是基于以上两个特征。细胞质蛋白缺乏信号序列和疏水区域。外周细胞质蛋白具有N端信号序列,但没有疏水区域。内膜蛋白通常不包含信号序列,但包含一个或多个疏水区域;外膜蛋白具有信号序列,但没有明显的不间断的疏水区域。应当注意,这些推测是基于α-螺旋结构,不适用于β-折叠结构。同时,内膜蛋白的拓扑特征可以通过“膜内阳性区”的规律推论得出,即跨膜蛋白面向细胞质的区域通常富含带正电荷的氨基酸残基,并且带负电荷的氨基酸残基的分布不影响蛋白质的拓扑特性。

VirB蛋白在N端具有两个信号序列:一个与细菌输出信号肽序列相似,并且具有一个共同的信号肽酶I裂解位点,符合“ Heijine-3,-1规则”,是,酶切割位点的第一位是丙氨酸或甘氨酸,而-3位是由丙氨酸,甘氨酸或其他小氨基酸组成;另一个是脂蛋白信号序列,它被信号肽酶II识别,并具有切割位点。点的-1位是丙氨酸或甘氨酸,而+1位被甘油化的半胱氨酸占据。 -2或-3位的氨基酸决定了脂蛋白在内膜和外膜上的位置。如果它是带负电荷的氨基酸残基,则该蛋白位于内膜中。如果它是不带电荷的氨基酸,则该蛋白质位于外膜中。可以看出,VirB蛋白具有跨膜或跨膜的特性,因此它可能具有改变细菌细胞膜结构的功能,从而形成了一种将T-DNA转移到细菌细胞外部的膜穿透通道。 。表9-1显示了由VirB区的11个ORF编码的蛋白质的性质和功能。

表9-1 VirB区编码的蛋白质的特征和功能

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可以看出,VirB蛋白不仅可以形成膜通道,而且可以是T-DNA复合物的组分。因为覆盖有疏水蛋白的T-DNA复合物对细菌和植物细胞膜之间的相互作用非常有利。

4. VirC区域

VirC和VirD共享一个共同的转录调控区,但转录方向相反。它是毒性区中唯一以逆时针方向转录的位点。它包含两个开放阅读框VirC1和VirC2,分别编码25kDa和22kDa蛋白。两个ORF之间只有两个核苷酸,并且前面有一个与大肠杆菌核糖体结合位点同源的SD序列。 VirC2位于VirC1的编码区域中。可以看出,这两种蛋白是翻译偶联的。

通过在T-DNA末端序列的负链的特定位点上切割VirD操纵子,可以将VirC与上述T-DNA末端序列之外的过驱动(OD)序列结合。 VirC1和超级驱动程序序列的组合需要被毒性诱导。 VirC2的功能尚不清楚。通过对VirC2突变体的分析,推测它也可能有助于T-DNA的转移。

5. VirD区域

Vi rD区至少包含4个ORF(VirD1〜4)),分别编码4种蛋白质,分子量分别为1 6. 2kDa,4 7. 4kDa,2 1. 3kDa,7 5. 7kDa分子都与T-DNA加工有关。

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VirD1编码1 6. 2kDa DNA松弛酶。与DNA拓扑异构酶的工作类似,它的作用是在DNA链上切割一个缺口,展开DNA然后关闭它,从而减少DNA超螺旋的数量。这种酶的作用不需要ATP参与,但是催化反应必须在Mg2 +的帮助下进行。

pirV2编码4 7. 2kDa蛋白,该蛋白具有裂解T-DNA末端的能力,并具有在与T-DNA复合物共价结合后引导复合物向植物细胞核移动的能力。 VirD1和VirD2蛋白是T-DNA边界加工核酸内切酶。在T-DNA的特定位点切割形成缺口后,T-DNA链开始合成以形成T-DNA-VirD2复合物。

不同类型的农杆菌菌株之间的VirD3蛋白同源性很小,其功能尚不清楚。

pVirD4蛋白在N端具有信号肽序列,这对于T-DNA转移到植物细胞中是必需的。 VirD4的C末端可能延伸到内膜和外膜之间的周质间隙,并结合一些未经证实的膜蛋白。

6. VirE区域

VirE包含两个基因VirE1和VirE2。 VirE2编码6 0. 5kDa蛋白,该蛋白与ssDNA紧密结合,但不具有序列特异性。研究预测,VirE2可能与T-DNA-VirD2复合物的T-DNA分子的5'端共价结合,形成T-复合物以保护其免受核酸酶降解。也许它们正在进入。合并植物细胞后,借助VirE2将其引入植物细胞核,最后整合到染色体基因组中。可以看出,VirE2在T-复合物的形成中不是必需的,但是对于有效转移T-复合物是必需的。 VirE1蛋白可确保VirE2蛋白的转运ti质粒图谱,但与T-DNA-VirD2复合物的转运无关。

7. VirF区域

在章鱼碱型Ti质粒中有一个VirF基因,但在胭脂碱型Ti质粒中没有。研究表明,VirE2和VirF通过VirB转运通道转运至植物细胞澳洲欢乐8app ,表明它们在植物中发挥功能,并有助于T-DNA向宿主植物细胞的转移。

8. VirH区域

VirH区域最初被称为pinF区域。在章鱼碱型农杆菌Ti质粒上有两个VirH基因,分别编码4 7. 5kDa蛋白VirHI和4 6. 7kDa蛋白VirH2。对VirH1蛋白和VirH2蛋白的作用尚未非常清楚地研究。通过对突变体的分析,认为它们可能对植物产生的某些杀菌或抗菌化合物具有解毒作用。

9. Tzs

Tps是胭脂碱型农杆菌Ti质粒所特有的,它编码与反式玉米素合成有关的细胞分裂素异戊二烯(间)二烯基转移酶产物。在细菌中表达后,玉米蛋白分泌到细胞外部。细胞分裂素被植物吸收后,可促进农杆菌感染部位植物组织的去分化和细胞分裂,提高植物对农杆菌转化的敏感性。

(三) Ti质粒的生物学功能

通过前面的介绍,不难发现土壤杆菌中的Ti质粒具有可以与植物细胞相互作用的非常完整的系统:一方面,通过感染植物细胞,可以诱导其产生Ti质粒所在的农杆菌。鸦片的碳和氮源;另一方面,诱导的阿片还充当分子“刺激剂”,诱导与其接触的Ti质粒上的编码,以控制阿片的共轭转移和分解代谢。没有农杆菌的Ti质粒。

简单地说,Ti质粒的功能可归纳为以下7个方面:使土壤杆菌具有附着于植物细胞壁的能力;诱导宿主细胞合成植物激素吲哚乙酸(IAA)和一些细胞分裂素;诱导植物产生冠gall瘤并确定诱导肿瘤的形态特征和冠gall的成分;赋予宿主菌株分解代谢各种冠gall化合物的能力;赋予宿主菌株对农杆菌的反应性;确定宿主菌株的植物宿主范围;一些Ti质粒可以抑制某些根癌农杆菌噬菌体的生长和繁殖,即它们对噬菌体具有“排他性”。

[关键词]蛋白酶色氨酸吲哚乙酸丙酮丙酮章鱼碱乙酰丁香酮