BB雷电pk Ti质粒技术介绍.ppt 47页

日期:2021-03-09 21:34:38 浏览量: 90

(四) Ti质粒载体及其构建1.植物基因工程载体的命名规则2.植物基因工程载体的类型3.植物基因工程载体的构建4.载体构建中常用的选择标记基因1植物基因工程载体的命名规则(1)天然质粒的首字母大写,并用括号括起来,例如(ColEL)。(2)重组质粒用小写字母p(质粒)表示,后跟两个大写字母)字母:大写字母是指构建质粒的研究人员或完成工作的研究机构,例如:pSCl01:SC(斯坦利·科恩的名字),pMT555:MT(曼彻斯特技术公司)曼彻斯特技术学院。(3)质粒在农杆菌属中的一般名称应在其名称中注明。例如,pTiT37,Ti代表根癌农杆菌,T37代表质粒编号或分类。2植物基因工程载体类型([k 5]靶基因克隆载体:靶基因克隆载体与微生物基因工程相似。通常,将多拷贝大肠杆菌小质粒用作载体,其功能是存储和克隆靶基因。 (2)中间克隆载体:中间克隆载体是插入T-DNA片段,靶基因和标记基因的大肠杆菌质粒。它是构建中间表达载体的基本质粒。2植物基因工程载体类型(3)中间表达载体:中间表达载体是含有植物特异性启动子的中间载体,其功能是构建转化载体质粒。

(4)解除武装的载体:解除武装的载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒,其功能是构建转化载体的受体质粒。[5)植物基因转化载体:植物基因转化载体最后是用于将靶基因导入植物细胞的载体,因此也称为工程载体,由中间表达载体和解除武装的载体构建而成,根据其结构特点,可分为两种类型。转化载体,即一元载体系统和二元载体系统。*主题植物基因工程载体一、根癌农杆菌和Ti质粒二、 Ri质粒载体三、 CaMV(花椰菜花叶病毒)载体系统四、脂质体(脂质体)载体一、根癌农杆菌和Ti质粒(一)根癌农杆菌和冠状胆瘤(二) Ti质粒和T-DNA的结构和功能(三) T-DNA转移(四) Ti pl载体及其构建(一)根癌农杆菌和冠gall肿瘤)植物与人类一样,可以产生多种肿瘤和癌症。一种类型的肿瘤称为胆囊,并且胆囊的类型很多。造成胆汁的因素有:受伤,昆虫,病毒,细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的胆汁是冠状胆囊肿瘤。 1.冠状胆囊肿瘤的病因是由植物感染引起的根癌农杆菌(根瘤菌家族)(Rhizobiaceat)。 2.冠状胆囊肿瘤,细菌的感染过程通过伤口进入植物,并在遗传水平上转化植物。

细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达,刺激植物细胞不受控制的分裂并形成肿瘤。冠gall瘤顶部:电子显微镜下的根癌农杆菌:冠gall瘤3.冠gall瘤的一般生物学特性(1) 45℃杀死根癌农杆菌感染植物,植物组织仍可形成癌。不含生长素和细胞分裂素的培养基,可以不受限制地分裂和生长(2)根癌土壤杆菌感染植物并产生两种物质:植物激素和冠crown。植物激素使细胞大量增殖,并出现冠gall肿瘤;冠gall是冠状菌是根癌农杆菌生活在其中的碳,氮和能源。[3)根癌农杆菌转化植物细胞的能力是因为它含有二) Ti质粒和T-DNA的结构和功能1. Ti质粒(1) Ti质粒是外面的遗传材料根癌农杆菌的染色体。双链共价封闭的环状DNA分子,分子量为95〜156×106D,约200kb。最近。有人发现农杆菌中还有其他质粒,称为隐性质粒。隐性质粒的功能仍不清楚,有人认为它们可能是有缺陷的Ti质粒。迄今为止,已经从多种植物中分离出不同类型的根。农杆菌癌。 (二) Ti质粒和T-DNA的结构和功能(3) Ti质粒的基因图谱基因图谱:Ti-DNA上的基因序列。

基因图的构建:转座子标记法使用细菌转座子(transposon)在Ti质粒中引起插入和缺失突变。细菌转座子携带各种抗生素抗性基因。可以在转化过程中将它们插入Ti质粒,使根癌农杆菌具有相应的抗生素抗性,方便筛选插入Ti质粒突变体中的转座子。由于转座子插入位点的编码基因被灭活,因此可以分析Ti质粒限制性核酸内切酶片段的变化(例如某些片段的消失或电泳迁移率的变化),以确定这些基因的插入位置并进行比较他们与突变体。对应于表型,从而建立了Ti质粒的基因图谱。胭脂碱型Ti质粒基因图谱(显示产生冠状胆囊肿瘤的Ti质粒上的几个重要基因位点)(二) Ti质粒以及T-DNA的结构和功能(4) Ti质粒基因位点及其功能区域①T- DNA区域(转移的DNA区域):T-DNA是从农杆菌感染植物细胞时从Ti质粒切下并转移到植物细胞中的DNA片段,称为转移DNA。转化的植物细胞的二倍体基因组包含一个或几个(最多)T-DNA拷贝T-DNA T-DNA结构:胭脂碱型T-DNA是15kb长的连续DNA片段,占钛的7-15%,两侧都有23bp的定向重复。

章鱼碱型T-DNA分为两个部分。左侧区域(TL-DNA)是一个13kb的单拷贝序列,对于诱导和维持肿瘤是必需的。右侧区域(TR-DNA)是一个7kb的多拷贝序列。 T-DNA通常相对完整,并整合到植物基因组中而不改变序列。 T-DNA携带的遗传信息①引起肿瘤的基因:用于转化植物细胞以使植物繁殖不可控制的致癌基因(onc基因)的基因。 ②Coronaine合酶及其分解基因:使植物细胞合成某些冠胆氨基酸的基因。例如nos(编码胭脂碱合酶的基因)和ocs(编码章鱼碱合酶的基因)(二))Ti质粒和T-DNA的结构和功能②Vir区(毒力区):需要转化。该片段上的蛋白可激活T-DNA的转移并使农杆菌具有毒性,因此被称为有毒区域,也称为有毒基因或Vir基因或致病基因。在质粒DNA上彼此相邻,共占Ti质粒DNA的约三分之一Vir区域的基因结构和功能Vir的位置:位于T-的左侧Ti质粒上的DNA,两者之间的距离通常随Ti质粒的类型而变化,但存在差异,章鱼碱型和胭脂碱型之间的距离很小Vir基因结构:章鱼碱型Ti Vir区: 40kb,包含8个操纵子,24个基因[VirA( 1),B(1 1),C(2),D(4),E(2),F(1),G(1)澳洲欢乐8app ,H(2)(PinF)] ,他们进行协调监管,形成监管者,并共同努力。

胭脂树素类型有7个操纵子。 Vir区域的基因结构和功能Vir A.细菌的基因功能附着在受损的植物细胞上。 B. Vir基因产物处理T-DNA形成单链DNA片段,将CT链(T链)转移到植物细胞中,整合到宿主基因组中,表达DT-DNA基因,植物细胞增殖并产生冠状花素。 (二) Ti质粒和T-DNA③Con区(编码结合的区域)的结构和功能:该区段包含与细菌之间的结合和转移相关的基因(tra),该基因调节Ti质粒在农杆菌之间的转移。激活tra基因并诱导Ti质粒的转移,因此被称为共轭转移编码区④Ori区(复制起点):该片段基因调节Ti质粒的自我复制起始。Ti质粒来自细菌(原核) )为什么其基因可以在真核生物中表达?证据1. T-DNA产生的mRNA是典型的植物mRNA分子og真人 ,可以被植物RNA聚合酶II转录,具有5'帽结构和3'PolyA。证据2. nos抢庄牛牛 ,ocs和其他基因的5'端具有真核生物特异性的TATA-box和CAAT-box。结论:T-DNA基因序列只能由真核生物识别yabobet ,而不能由原核生物识别。

这表明这些基因可以在真核细胞中表达,并且只能在转化为真核细胞后才能表达。 ([三) T-DNA转移1. Vir基因诱导2. VirA和VirG在结构上表达3. T-DNA处理,并将4. T-DNA链整合到植物基因组中[三) T- DNA转移1. Vir基因诱导的细菌靠近易感的受害植物,受害植物产生酚类物质(例如烟草组织产生的乙酰丁香酮),并诱导Ti中的Vir基因表达。章鱼类型(ocs))质粒具有8个Vir操纵子:VirA,VirB,irC,VirD,VirE,VirFti质粒图谱,VirG,VirH。胭脂碱类型(Nop)具有7个Vir操纵子:VirA,VirB,VirC,VirD,VirE,VirG,Tzs(三) T-DNA转移2. VirA和VirG在结构上表达(1) VirA基因产物VirA蛋白是细菌细胞膜上的疏水蛋白,是植物酚类物质(如乙酰丁香酮(2) VirA蛋白和酚类物质导致VirG基因产物VirG蛋白磷酸化VirG蛋白是一种转录激活物演说家。其磷酸化形成可与其他Vir基因启动子相互作用的DNA结合蛋白。将特定的12bp序列组合以将其打开。

因此,磷酸化将virG蛋白从非活性状态转变为活性状态。酚的VirA和VirG结构表达激活VirA(膜上的疏水蛋白)VirG未由Vir表达的VirG-P基因被激活并开始表达与特定12bp序列结合的转录因子(三) T-DNA transfer 3. T- DNA加工和转移(1)农杆菌附着到植物细胞后,它仅停留在细胞间空间。首先对T-DNA进行处理,剪切和复制,然后再转移到植物细胞中,而不是整个Ti质粒进入植物细胞2)激活了Vir基因操纵子系统,表达了VirD(编码VirD1和VirD2蛋白,共同决定核酸内切酶的活性),并在边界重复序列的特定位置形成了切点,从而在单链断裂中(三) T-DNA转移(3) T-DNA复制首先在底部链的25bp重复序列的右边缘从左侧的第3个和第4个碱基之间进行)切开间隙,然后从t合成一条新的DNA链在缺口的3'端,将其延伸到左边界的22位碱基,取代原来的下链形成ssDNA,即T链。 T-DNA复制VirD蛋白的作用:(1)保护5'端免受5'核酸酶的攻击;(2) VirE蛋白作为T-DNA进入植物核的指导:编码ssDNA结合蛋白的蛋白ti质粒图谱,与T链等单链T-DNA结合,成为有核蛋白丝,操作方便。

(三) T-DNA转移(4) T链复合物通过细胞膜穿过膜的运输通常需要在蛋白质N端的信号肽,这可以帮助细菌穿过细菌。内膜(IM),在特定的肽酶切割信号肽后,运输停止,T链复合物操作的活性物质可能是VirB蛋白,根据其功能可将VirB蛋白分为5类:R:在内膜或内膜中的某些蛋白质可能充当T复合物的受体A:它们可能充当能源,并充当ATPase来促进T复合物被泵出细菌细胞。 C:形成通道VirB4可能是一种“ C”蛋白VirB4是一种富集的蛋白uu彩票 ,没有疏水区域,也没有信号肽,可能在T链运输和S:至少是特殊通道结构的一部分S:载体蛋白h起到通过通道携带T络合物的作用。这种蛋白质可能与所有膜成分(内膜和周质)有关。 P:位于外膜上,它可以作为与植物细胞膜结合的受体,通过Vir B通道P输出T复合物的示意图。 S.T复合载体蛋白; C.通道蛋白; A.ATP酶; RT复合体受体; VirD 2.核定位信号; VirE 2.确保T复合物进入膜孔时不受干扰。 (引自Vogel等人,199 2)(三) T-DNA转移4.。T-DNA链由于部分解旋5'-3`核酸外切酶而整合了植物基因组,形成了靶DNA缺口。消化形成缺口。

单链T-DNA接近缺口。由于两条链具有短的DNA互补序列,因此它们退火形成异源双链体。 T-DNA末端和目标DNA连接到目标DNA链的互补链以产生缺口。游离的3`DNA末端用作修复和合成第二条T-DNA链的引物* * * *道尔顿是原子质量单位,在生物化学,分子生物学和蛋白质组学中经常使用D或KD,定义为1/12碳原子12的原子质量中的1D = 1 / N g,N是阿伏伽德罗常数,* noc是通过编码细菌基因来使用胭脂碱。